相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS)

相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS) 是一種非線性四波混合過程，用于增強(qiáng)弱（自發(fā)）拉曼信號。在 CARS 過程中，泵浦激光束（在泵浦頻率）和斯托克斯激光束（在斯托克斯）相互作用，產(chǎn)生一個(gè)反斯托克斯信號，頻率為CARS = 2泵浦-斯托克斯。斯托克斯光束 ( Stokes ) 通常由來自 Nd:Vanadate 激光器的 1064nm 線提供，該激光器還充當(dāng)光學(xué)參量振蕩器 (OPO) 的泵浦源，而來自 OPO (680-1010nm) 的輸出充當(dāng)泵梁（泵）。當(dāng)泵和斯托克斯光束之間的頻率差（拍頻）與（拉曼主動）振動模式的頻率相匹配時(shí)，例如~2800 cm -1處的 CH 2對稱拉伸模式，分子振蕩器被相干驅(qū)動。這導(dǎo)致增強(qiáng)的反斯托克斯（較短波長）拉曼信號，這是提高 CARS 顯微鏡振動對比度的基礎(chǔ)。

圖 1：相干反斯托克斯散射 (CARS) 能量圖和實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。
CARS 顯微鏡

從 CARS 顯微鏡的發(fā)展中受益匪淺的兩個(gè)領(lǐng)域是細(xì)胞生物學(xué)和組織成像。通常，細(xì)胞詢問是使用熒光顯微鏡進(jìn)行的。借助 CARS，可以在亞微米級進(jìn)行化學(xué)特異性、無標(biāo)記成像。迄今為止，CARS 顯微鏡已顯示其在活組織中的脂質(zhì)代謝、細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物擴(kuò)散（藥代動力學(xué)）研究中的潛力。CARS 顯微鏡也已用于臨床應(yīng)用，并且已經(jīng)證明了健康腦組織中腫瘤塊的快速、視頻速率成像。

圖 2：來自固定組織樣本的棕櫚酸膽固醇的 CARS 顯微鏡圖像。

左側(cè)的圖像是使用 CARS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)中常用的發(fā)射濾光片獲得的。

右側(cè)的圖像是使用 Semrock 產(chǎn)品 FF01-625/90 獲得的，在相同的樣本 ROI 上顯示了增強(qiáng)的圖像對比度。獲取這些圖像時(shí)使用了相同的激光強(qiáng)度和 PMT 設(shè)置

受激拉曼散射 (SRS)

在 SRS 顯微鏡中，與 CARS 顯微鏡一樣，泵浦光子和斯托克斯光子都入射到樣品上。如果頻率差SRS = pum p - Stokes匹配分子振動 ( vib) 發(fā)生振動過渡的受激激發(fā)。與 CARS 不同的是，在 SRS 中，沒有與激光激發(fā)波長不同的波長的信號。相反，泵浦波長處的散射光強(qiáng)度經(jīng)歷受激拉曼損耗 (SRL)，而斯托克斯波長處的散射光強(qiáng)度經(jīng)歷受激拉曼增益 (SRG)。SRS 顯微鏡相對于 CARS 顯微鏡的主要優(yōu)勢在于它提供了具有改進(jìn)圖像對比度的無背景化學(xué)成像，這兩者對于生物醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用都很重要，其中水代表樣品中非共振背景信號的主要來源。

圖 1：SRS 四波混頻過程的受激拉曼散射 (SRS) 能量圖（右）。無標(biāo)記刺激拉曼獲得人類黑素細(xì)胞中脂質(zhì)的成像。

表面增強(qiáng)拉曼散射 (SERS)

拉曼信號本質(zhì)上很弱，尤其是在使用可見光激發(fā)時(shí)，因此可用于檢測的散射光子數(shù)量很少。放大弱拉曼信號的一種方法是采用表面增強(qiáng)拉曼散射 (SERS)。SERS 使用納米級粗糙金屬表面，通常由金 (Au) 或銀 (Ag) 制成。這些粗糙金屬納米結(jié)構(gòu)的激光激發(fā)共振驅(qū)動表面電荷，產(chǎn)生高度局部化（等離子體）光場。當(dāng)分子被吸收或靠近表面的增強(qiáng)場時(shí)，可以觀察到拉曼信號的大幅增強(qiáng)。比正常拉曼散射大幾個(gè)數(shù)量級的拉曼信號很常見，因此可以檢測低濃度 (10 -11) 無需熒光標(biāo)記。當(dāng)粗糙的金屬表面與與分子的吸收最大值匹配的激光結(jié)合使用時(shí)，拉曼信號可以被進(jìn)一步放大。這種效應(yīng)被稱為表面增強(qiáng)共振拉曼散射 (SERRS)

圖 1：SERS 的概念圖。

SERS 越來越多地用于各種應(yīng)用，包括：

基本分析化學(xué)測試

藥物發(fā)現(xiàn)

法醫(yī)現(xiàn)場測試

檢測痕量的化學(xué)和生物威脅劑

即時(shí) (POC) 醫(yī)療診斷設(shè)備

圖 2：SERS 示例：來自純白色念珠菌、純大腸桿菌和兩者混合物的 SERS 光譜。特征峰由陰影框表示。